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重組蛋白純化工藝開發的原則和策略

2022-11-19 11:24:08

重組蛋白純化的基本原則

蛋白的分離純化是生物工程下游階段一個比較重要的部分,尤其在基因工程重組蛋白的分離純化中,上游過程的許多因素會直接影響到下游蛋白的分離,充分利用上游對下游的影響,對蛋白的純化做一個全面的考慮和整體的設計。是否帶有親和標簽,His標簽,GST標簽等,不同的親和標簽選擇不同的純化方案;可能是可溶性表達,可能形成包涵體,可溶性的蛋白往往需要復雜的純化步驟,而包涵體易于分離,純度較高,但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當困難,需要對聚集的蛋白進行變復性,通常活性蛋白的得率比較低;是否對宿主細胞具有毒性,從而選擇抗毒性的表達系統;怎樣選擇表達系統,是大腸桿菌表達系統,酵母表達系統還是CHO細胞表達系統,不同的表達系統和培養方法顯著影響下游的處理過程,目標蛋白表達的定位(胞內、細胞內膜、周質空間和胞外),蛋白表達的量都依賴于所選擇的表達系統;蛋白的化學性質,是否容易被蛋白酶降解,是否會和一些金屬離子,化學成分發生反應;蛋白的物理性質,是否對溫度敏感等。從蛋白基因的獲取,蛋白基因的克隆,蛋白的表達,做好一個整體的規劃,將對純化工作的方便快捷高效帶來關鍵的影響。

基因工程構建的純化標記有很多,通過改變 cDNA在被表達的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸,這個加入的標記可用來作為一個有效的純化依據。GST融合載體,蛋白A融合載體,含組氨酸標記(His-tagged)等,不同親和標簽的蛋白有不同的純化方案。

選擇親和標簽時注意的問題

親和標簽與目標蛋白之間的作用是相互的,需要綜合的考慮,既要考慮到對目標蛋白結構功能的影響,又要考慮到對標簽與其配體親和作用的影響,以及實際的用途。

幾種常規蛋白純化標簽比較

(1)親和標簽是否會影響到目標蛋白的結構和功能,大多數情況首選短的多肽標簽,這是因為短的肽標簽對目標蛋白的結構影響最小,而大的親和標簽可能限制重組蛋白的折疊,影響蛋白質的生物學功能。

(2)親和標簽對蛋白質穩定性的影響,親和標簽的加入是否會影響到目標蛋白的正確折疊,是促進目標蛋白的可溶性,還是容易形成包涵體,會不會造成氨基酸C和N端破壞,使目的蛋白表達不完全。

(3)親和標簽所融合的位置,親和標簽可以加在N端,可以加在C端,也進行串聯。多數情況下蛋白質的N端區域對蛋白質的功能不是太重要,所以在N端進行融合標簽的融合常常能保留蛋白質的生物學功能。由于N端DNA序列對蛋白質的轉錄翻譯影響較大,所以標簽加在N端對蛋白質的表達水平影響更大,優化標簽的mRNA結構可使表達水平提高。可能有些蛋白純化后需要去除親和標簽C端融合在去除融合標簽后在目標蛋白的C端會有幾個氨基酸殘留,而小心的選擇剪切特異性的氨基酸序列就可以在去除N端親和標簽后得到天然的目標蛋白。

(4)親和洗脫的條件,有些條件比較溫和,而有些條件較為劇烈,選擇的親和表達系統應該不使目標蛋白變性。

常用親和標簽

HIS標簽

His標簽是當前最為熱門的標簽蛋白之一。His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用,一是能構成表位利于純化和檢測;二是構成獨特的結構特征(結合配體)利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力,可用于固定化金屬螯合層析(IMAC),對重組蛋白進行分離純化。

Flag-tag

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽(DYKDDDDK),同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。


AviTag

是一個15個氨基酸的短肽,具有一個單生物素化賴氨酸位點,與已知天然可生物素化序列完全不同,可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后,可被生物素連接酶生物素化,為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物,除了用于蛋白質分離純化,還用于蛋白質相互作用研究。

SNAP-Tag 

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase)獲得。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團,釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。 

檢測:生物素或各種顏色熒光的底物(如熒光素、若丹明)可滲透進入細胞,方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌,酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)

GST標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶,它的天然大小為26KD。GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達,可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。

純化:該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。

如果要去除GST融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。

GFP

GFP(綠色螢光蛋白)是由下村修等人在水母中發現的。它在藍色波長范圍的光線激發下,會發出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質的C端或N端,該系統已廣泛應用于各種細胞類型,包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等,相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質之間相互作用和構象變化中,起到了重要的作用。

常規化的c-Myc

C-Myc標簽蛋白,是一個含11個氨基酸的小標簽,它作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中,可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。

 熒光素酶(luciferase):

來源于生物體內的熒光素,常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學研究中,這種技術被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法(Luciferase Assay)。跟普通融合蛋白標簽不同,使用熒光素酶構建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3'UTR克隆的功能與調控,因為它們對目的基因的調控可以是漸變的,而不是簡單的開和關兩種狀態。

廣泛使用的融合標簽的分子量比較(來源:網絡)

如何選則重組蛋白表達時的標簽

1、首先,需要確定融合標簽的目的

蛋白純化 :標簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用于細胞內源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應用于大腸桿菌的蛋白純化。可是哺乳動物細胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景,因此極少使用6XHis Tag。

Western Blot檢測:若需要做Western Blot實驗來檢測細胞裂解物中蛋白的表達,你可以選擇有匹配的抗體的小分子標簽。FLAG Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業化的抗體等優勢,成為Western Blot實驗中常用的Tag。

免疫沉淀反應:FLAG Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業用抗體等優勢成為免疫沉淀反應中最常用的Tag. 其他常用的標簽有:HA和cMyc.

活細胞成像:熒光蛋白(Fluorescent Proteins, FPs)是活細胞成像常用的標記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白(GFP)和它的衍生物(CFP, YFP, etc.),以及一些紅色變體,如dTomato和mCherry.

···

2、考慮融合標簽的影響

任何一類標簽處于氨基酸序列的任一位置,都具有影響目的蛋白表達或功能的可能性。最主要原因是標簽可能會干擾蛋白的正確折疊,致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次,標簽可能會中斷亞細胞定位信號,這種情況下,蛋白能夠正確翻譯和折疊,但在細胞內所處的位置是錯誤的。因此,您需要知道添加的標簽對目的蛋白的表達是否有影響。

3、考慮是在N-端還是C-端標記

N-端或C-端標記的選擇還需要根據蛋白結構、定位等特性。然而,倘若你沒有確切的蛋白結構,或蛋白功能域圖譜,建議分別構建N-端標記和C-端標記的表達克隆,以檢測哪個更有效。

樣品的預處理

1.誘導方式:

誘導方式的選擇上,為了得到正確折疊的目的蛋白,表達菌種的生長情況,菌種是否健壯,是否是單克隆菌種,菌體的濃度是否適合誘導,生長狀態不好的表達菌,一方面會造成目的蛋白的錯誤折疊,造成蛋白大小,形態等發生改變,另一方面會因為IPTG的加入,導致菌體的死亡或者降解。

低溫度誘導有助于蛋白二硫鍵的正確折疊,但對于高溫表達的蛋白不適合低溫狀態,溫度過高容易導致包涵體的形成。

2.誘導劑:

基因的誘導表達基于乳糖操縱子調節機制,沒有乳糖存在的時候,阻礙物基因產生阻礙蛋白,阻礙蛋白和操縱子結合,抑制基因的表達;當有乳糖存在的時候,B-半乳糖苷酶和乳糖作用產生異半乳糖,異半乳糖和阻礙蛋白結合,解除抑制,激活基因,開始表達蛋白。誘導的濃度的高低對目的蛋白的表達也會有產生影響。BL21(DE3), Rosetta(DE3)等大腸桿菌表達系統這些菌株都敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌體DE3。DE3是的一種衍生λ噬菌體,帶有噬菌體21抗性區和 lacI基因,lacUV5啟動子,以及 T7 RNA聚合酶基因。這一區段被插入int基因,因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶原狀態,就只有受IPTG誘導的lacUV5啟動子指導T7 RNA聚合酶基因轉錄,在溶原培養體系中加入IPTG誘導T7 RNA聚合酶生產,繼而質粒上的目的DNA開始轉錄。

3.收獲方式:

進行破壁之前應該選擇合適的緩沖組分, 合適的pH 要結合酸堿溶液的滴定調節,盡量低的離子強度 ,加入一些穩定成分穩定成分,EDTA螯合重金屬離子,Triton X-100,NP40等表面活性劑,保護非極性表面等。

4.確定蛋白質樣品的形態,濃度 黏度 體積。

有時候得到粗蛋白的時候,會觀是否符合目的蛋白的一些性質,確保得到是目標蛋白。粗蛋白的形態有沒有明顯的差異,濃度是否符合純化的要求,是否有較多的干擾物質,核酸 色素 強結合成分。

5.優化表達條件

(1)重組蛋白不表達或者表達量低。如果重組蛋白不表達(包含體和可溶蛋白都沒有)通過改變誘導劑濃度,誘導溫度,時間等都不表達的時候,然后嘗試更換菌株、質粒載體。

降低誘導后培養溫度。重組蛋白表達得越慢,其折疊效果就越好,大腸桿菌在4℃時依然可以表達重組蛋白,而將培養溫度降低至25-30℃就能顯著改善蛋白折疊。此方法不適用于溫度誘導的重組蛋白表達;

減少誘導劑。誘導劑濃度可以降低至1/10;選用Lac滲透酶缺陷型菌株,如Tuner、Rosetta等,也有很好的效果。這類菌株能夠使進入每個細胞的誘導劑濃度相同。重組蛋白在所有細胞中的表達水平相當時,減少誘導劑的效果更好。

(2)檢查密碼子構成,使其適應宿主菌的密碼子偏好。稀有密碼子,尤其是位于重組蛋白N端的和大量集中的稀有密碼子,會降低mRNA穩定性,顯著降低翻譯速度,引起翻譯提前中止、翻譯移碼和突變。將這些稀有密碼子(尤其是N端!)突變為宿主偏好的密碼子,能夠顯著提高表達水平。改善蛋白穩定性。能夠引起蛋白降解的因素很多,從蛋白自身性質到宿主性質不一而足,如果重組蛋白在表達時就被降解,表達量和穩定性就會受到很大影響。在大腸桿菌中表達重組蛋白,需要牢記N端法則:當N端第二個殘基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp時,重組蛋白半衰期只有2分鐘,而小側鏈的氨基酸殘基,如Ala,則可以提高蛋白穩定性。因此在設計載體時,要特別注意第二個密碼子,避免上述殘基的出現。

處理高毒性蛋白:毒性極高的重組蛋白,其本底表達就會殺死原核宿主,質粒容易丟失,使其在大腸桿菌中很難得到高表達。采用可表達T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制劑,采用含有T7溶菌酶質粒的宿主,如pLysS,可以降低重組蛋白在大腸桿菌快速生長期的本底表達量,在受到IPTG誘導時也能較好的表達蛋白。

(3)包涵體表達:包涵體蛋白折疊混亂、二硫鍵配對混亂、沒有生物活性、變復性條件需要長時間摸索等,即使包涵體蛋白成功復性,其均一性和活性依然備受質疑。但是包涵體表達也有其優勢:能夠很輕松的獲得超高的表達量,不可溶的重組蛋白不會被宿主內的蛋白酶降解,重組蛋白的毒性被大大抑制,雜蛋白含量低(~10%),容易純化等。由于這些優點以及蛋白質復性條件的不斷發展,表達包涵體蛋白逐漸為人們所接受,成為重組蛋白表達的一個常用方案。與可溶蛋白相反,提高培養溫度、延長培養時間、在較高的菌密度下誘導都有利于包涵體的形成;在破菌和變性溶解時加入還原劑能夠打開錯配的二硫鍵;在復性液中加入二硫鍵異構酶、脯氨酸異構酶、分子伴侶和蛋白的輔助因子可以幫助重組蛋白折疊;精氨酸和高分子量PEG能減輕蛋白分子的聚集;嘗試多種物理手段,如透析、快速稀釋和柱上復性等,有時對復性有奇效。包涵體的表達相對簡單,但其復性過程仍是依賴經驗的,沒有通用的方法可以套用。


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